Por Manuela Martínez y Esther Lorenzo
Ciclo superior de laboratorio de análisis clínicas
I.E.S. «Manuel Antonio»
Vigo

Indice

• Agradecimientos
• Introducción
• Justificación del trabajo
• Metodología y técnicas de desarrollo
• Desarrollo
• Conclusiones
• Apéndice
• Bibliografía
• Glosario de términos

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Agradecimientos

 

Dolores Presa. Técnico de laboratorio clínico, en el Servicio de Laboratorio de Urgencias en el Hospital del Meixoeiro.

Dra. Carmen Ferreiros. Analista  en el laboratorio del hospital Meixoeiro.

Dra. Inmaculada González. Residente de cardiología en el Hospital del Meixoeiro.

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Introducción

El uso de las troponinas cardíacas como biomarcadores comenzó a principios del decenio de 1990.

El complejo troponina T(cTnT) fue descrita en 1989 y el complejo troponina I (cTnI) en 1992.

Inicialmente, se creyó que las troponinas cardíacas eran biomarcadores específicos de infarto agudo de miocardio. Posteriormente, en 1999 muchos estudios [1] demostraron que las troponinas podían estar aumentadas en diferentes procesos no cardíacos, así como en trastornos cardíacos diferentes de los síndromes coronarios agudos, como la insuficiencia renal crónica, la sepsis, la enfermedad por VIH, trastornos del sistema nervioso central y neuropatías.

Actualmente los procesos en los que las troponinas cardíacas pueden estar aumentadas aún han crecido más con muchas enfermedades relativamente comunes, como la embolia pulmonar, y trastornos más raros, como la amiloidosis cardíaca. Sin embargo, con independencia de la naturaleza de la enfermedad subyacente, la fuente de las troponinas cardíacas siempre es el corazón, pues tanto las troponina cardíaca I como la T tienen su origen exclusivamente cardíaco.

[1] Ijaz A Khan “Aumento de la troponina no isquémico” 16 marzo 2007 http:www.harrisonmedicina.com

.

 

Justificación del trabajo

Se realiza este proyecto para comprobar si podría ser viable la determinación de troponinas en el laboratorio de bioquímica como parte de la programación del módulo de fundamentos y técnicas de análisis bioquímico ciclo superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Es una determinación poco laboriosa que fácilmente se podría realizar en el laboratorio de prácticas del centro de estudios, pero debido al alto coste del aparato que se precisa no lo hace viable.

Ref.: http:www.medical.siemens.com

 

Metodología y técnicas seguidas en su desarrollo

El proyecto se estructuró elaborando los siguientes pasos:

• Obtención de información:
• Documental a través:
  • libros de medicina (Harrinson medicina)
  • revistas especializadas (revista de cardiología)
  • páginas profesionales en Internet
  • protocolos (Dimension)
• Profesionales:
  • técnico en laboratorio clínico
  • residente en cardiología(4º año)
  • médico analista del laboratorio de urgencias. Hospital Meixoeiro
• Elaboración de PNT
• Supuesto práctico de una determinación de troponinas realizado en el Hospital Meixoeiro
• Elaboración de un presupuesto del coste de una determinación de troponina
• Conclusión

 

Desarrollo

La Troponina (Tn) es el complejo proteínico regulador de la función contráctil del músculo estriado.

Composición química:

Consta de tres componentes polipeptídicos distintos:

• Troponina C, que fija el Calcio (Ca).
• Troponina T (TnT), que liga el complejo troponina a la tropomiosina.
• Troponina I (TnI), que es la subunidad inhibidora del complejo troponina-tropomiosina.

Este complejo sirve para regular la interacción calcio-dependiente de actina y miosina, por eso juega un papel integral en la contracción muscular.

Cada una de estas tres subunidades de Troponina existen en diferentes isoformas, que  son específicas del tipo de fibra muscular del que proceden.

Los filamentos delgados del músculo estriado además de estar formados por actina, contienen dos proteínas principales accesorias, que ejercen una función reguladora controlando la construcción y la ruptura de los puentes transversales entre los filamentos gruesos y delgados, así como la producción de energía mecánica. Una de ellas es la tropomiosina, molécula fibrosa que consta de dos cadenas alfa y beta que se adhieren a la actina F entre los dos polímeros. Las moléculas de tropomiosina se asocian por los extremos y cuando cristalizan forman un retículo cuadricular.

La segunda proteína reguladora importante es la troponina, proteína globular de gran tamaño que contiene las tres subunidades.

Ref.: Francisco Navarro- Lopez “Revista española de cardiología” vol 57 2004

La subunidad fijadora de calcio de la troponina es la TnC, cada molécula de TnC enlaza fuertemente a dos iones de calcio y simultáneamente experimenta un cambio de conformación.

La subunidad inhibidora de la troponina es la TnI, posee un centro de unión específico para la actina; su función consiste en inhibir la interacción de la actina con los puentes cruzados de la cabeza de la miosina.

El tercer componente de la troponina TnT, es una subunidad fijadora de tropomiosina.  Las isoformas T e I tienen diferente estructura proteica y son específicas del corazón. Ambas han mostrado alta especificidad y sensibilidad para el diagnóstico de infarto de miocardio. En la cirugía cardíaca sus concentraciones se relacionan con el tiempo de pinzamiento aórtico.

La TnI es el marcador de elección para el diagnóstico del infarto agudo del miocardio, porque aparece rápidamente después del accidente coronario y se mantiene por mucho tiempo en la circulación. Se recomienda la recogida de al menos tres muestras de sangre. Los niveles de troponina I son detectables transcurridas 3-6 horas desde la aparición del dolor en el pecho, alcanzando el nivel más alto aproximadamente a las 12- 16 horas y pueden mantenerse elevados 4- 9 días . Se prefiere la TnI y no la TnT porque esta última se expresa en otros músculos aparte del corazón. Sin embargo, se ha indicado que en las dos primeras horas después de ocurrido el infarto aparece primero la mioglobina, aunque esta no es específica del músculo cardíaco.

 

La troponina I cuantitativa

Valor de referencia: Negativo = <0.4 mgldl (repetir la prueba en 4-6 horas si clínicamente está indicado). 0.4-2.0 ng/ml = se sospecha daño miocárdico (varias mediciones pueden ser necesarias para confirmar o excluir el diagnóstico de síndrome coronario agudo).Repetir el test en 4-6 horas si es necesario. > de 2 ng/ml= compatible con infarto de miocardio. Se recomienda una correlación entre el laboratorio y la clínica.

Método de quimioluminiscencia

La nueva generación de los analizadores primeros en la consolidación de tecnología y líderes en los laboratorios de urgencias incorpora la tecnología quimioluminiscente avanzada Loci para la determinación de marcadores cardíacos con una troponina de alta sensibilidad, listo para el uso de 24 horas al día garantizando siempre el mismo tratamiento de respuesta para todas las muestras.

El método TNI de Dimension® es un inmunoensayo tipo sánwich homogéneo.

La quimioluminiscencia es un método de lectura que se basa en el principio de emisión luminosa a través de una reacción ( enzima – sustrato).Este método posee una gran especificidad y sensibilidad ya que se puede determinar una reacción antígeno-anticuerpo del orden de los picogramos y con un mínimo de desnaturalización.

En la quimioluminiscencia (directa) tipo sanwich emplea como fase sólida, micropartículas paramagnéticas recubiertas de anticuerpos específicos contra la sustancia a analizar y como marca el éster de acridina.

Este ensayo es de tipo hetereogéneo y se caracteriza de por emisión de luz visible debido a una reacción química producida por la oxidación del éster de acridina empleado como marca.

Ventajas

El no empleo de material radioactivo reducen los costos de mantenimiento y contaminación. Debido a que este es un método automatizado el tiempo de elaboración de la prueba es mucho más corto y mucho menos tedioso. Con esto teóricamente puede decirse que la quimioluminiscencia es un método alternativo para aquellos laboratorios grandes y pequeños que deseen montar estos inmunoensayos sin mayor complicación como lo es el RIA.

Ref. : Jan R. Wikipedia commons

 

PRESUPUESTO:

Caja de reactivos Flex® reagent cartridge de TnI, ref. RF621
de 60 unidades ……………………………………………………. 180 euros

Reactivo utilizado por troponina ………………………………………… 3 euros

 

Fotografía realizada al analizador Dimension EXL en el hospital Meixoeiro. Corresponde a la zona donde se colocan los cartuchos de reactivos.

 

Supuesto práctico

Fundamento:

Realizar la determinación de las troponinas en una muestra de sangre llegada del servicio de urgencias para descartar o confirmar un infarto de miocardio en una paciente que acude a éste servicio por dolor en el pecho.

Material:

• Centrífuga
• Analizador EXL Loci Dimension®
• Tubos eppendorf
• Reactivos
• Pipetas Pasteur desechables

Foto: autoras

Muestra:

Sangre en tubo con heparina de litio

Imagen donde podemos ver los tubos con el suero después de haber sido centrifugada la sangre, preparados para meter en el analizador.

 

Realización:

Recibimos  la muestra de sangre en el laboratorio (nº 8335), se registra los datos en el  software “mlx” (código del servicio del que procede, código del médico que hace la petición, datos del paciente).

La muestra de sangre recibida la centrifugamos  10 minutos a 3500 rpm. Una vez centrifugada se  retira el tapón (éste es de color verde con heparina de litio el cual se retirará ya que se podría romper la aguja del analizador EXL Loci Dimension®)  y se introduce en una de las cubetas de éste  dejando el código de barras hacia la luz roja del lector. Si la muestra fuera escasa la pasaríamos a las copas ssc con una pipeta plástica y ésta se pondría dentro del tubo.

Al analizador se le hace control cardíaco por la mañana el nº1, a la tarde el nº 2 y  por la noche el nº 3.

El Dimension además tiene otras funciones como leer algunos antibióticos: tobramicina, amikacina, gentamicina, vancomicina; proteínas de líquidos biológicos ( LCR, líquido pleural, ascítico, sinovial…); amonio teniendo sumo cuidado con no introducir las muestras con dióxido de carbono y amonio por la evaporación que produce.

Durante el procesamiento en el analizador se enciende una alarma de color roja que pide el reactivo (ref. EB1272 TNI ) previamente calibrado por los analistas. En este caso es líquido pero puede ser en pastillas.

Vista interior del Dimension (Hospital Meixoeiro)

Fotografía realizada a la cubeta donde se colocan los tubos para su analizado

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Resultado:

Una vez terminado el proceso tenemos que esperar que la luz del Dimension se apague.

El resultado de la determinación es inferior al rango de ensayo, por lo cual, para asegurarnos repetimos la prueba en otro analizador Dimension por si hubiera algún tipo de error.

Obtenemos los segundos resultados. Como son iguales a los anteriores vemos los protocolos resultando la troponina negativa (troponina inferior a 0,04 ng/mL).

Terminamos validando el resultado en el Sampel.

VALORES FUERA DEL RANGO DE ENSAYO – DIMENSION.

El DIMENSION diluye algunos resultados fuera de rango (lo indica poniendo al lado:diluido).

Valor por debajo del rango de ensayo: repetir por si no ha aspirado suficiente muestra (burbujas, fibrina, poca muestra).

Valor por encima del rango de ensayo: diluir; si diluido aún da rango ensayo, seguir con diluciones mayores.

Software Sampel

Observaciones:

– Los facultativos no suelen pedir la troponina sóla, siempre va acompañada de otros marcadores cardíacos.

– CK, CKMB y troponina deben subir o bajar juntas; siendo la CK no específica de cardiología ya que puede subir por fármacos o por problema muscular. Si esto ocurriera tenemos que repetir la prueba en el otro Dimension.

– Persona con riesgo de infarto y troponina elevada avisaremos al servicio de urgencias.

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Dilución Troponinas Altas

1/5: 25 microlitros muestra + 100 microlitros diluyente TNI (echar primero la muestra y luego el diluyente)Mezclar bien. Si hay que seguir diluyendo:

1/25: 25 microlitros de dilución1/5 + 100 microlitros de diluyente TNI. (primero la dilución 1/5 y luego el diluyente).Mezclar bien.

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Con hemólisis rechazar potasio y amonio, se pueden obtener resultados más altos de lo normal.

centrífuga

Rotor de centrífuga

Conclusiones

 

La troponina T o I se ha constituido como el marcador de referencia para el diagnóstico de infarto de miocardio. Los diferentes laboratorios centrales hospitalarios optan por alguna de las múltiples empresas manufacturadoras de biomarcadores, lo que da lugar a diferentes niveles de corte para el diagnóstico de infarto de miocardio en función del kit analítico empleado. Los actuales biomarcadores han aumentado su nivel de precisión diagnóstica, permitiendo la detección de mínimas elevaciones de troponina en sangre. Esta nueva generación del proceso analítico ha dado paso a métodos ultrasensibles.

Un aspecto interesante que ofrece estas nuevas troponinas ultrasensibles es la posibilidad de detectar más precozmente la necrosis miocárdica, anticipando por tanto el diagnóstico de infarto así como su pronóstico y probablemente acortando en algunos casos el periodo de observación en urgencias.

 

Apéndice

Analizador automático que utiliza la tecnología quimioluminiscencia usando pequeños volúmenes de muestra que pueden ser procesados con una alta exactitud y precisión. No precisa de reactivos, solución buffer y otros elementos adicionales. Sistema de análisis ideal para laboratorios  de emergencia, hospitales y consultas médicas. Ordenador e impresora integrados, sistema de código de barras, y puede ser conectado al sistema informativo del laboratorio.

Ref.: Castrillo “Marcadores cardíacos” Técnicas hospitalarias

ALMACENAMIENTO DE LOS PACIENTES: hasta 1000 resultados

CONTROL CALIDAD: 1800 datos

CALIBRACIONES: hasta 300

CARACTERÍSTICAS:

• sangre total
• fácil manejo
• 1 a 6 determinaciones en 17 minutos

CALIDAD ANALÍTICA:

• Calibradores y controles
• Resultados cuantitativos con alta sensibilidad
• Control automático de la temperatura de las muestras de los reactivos, de la reacción y de la cubeta de lectura
• Amplios rangos de medición
• Volumen de la muestra 50- 100 microlitros

1. Propósito y alcance:

En caso de infarto agudo de miocardio. El propósito de este procedimiento es el diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de troponina cardíaca en suero y plasma como ayuda en el diagnóstico del infarto agudo miocardio y daño muscular cardíaco.

2. Fundamento:

La troponina es una proteína que regula la contracción del músculo estriado, constituida por tres subunidades T, C e I. La troponina I es la de mayor interés diagnóstico, es originaria de la musculatura cardíaca y es un marcador altamente sensible del desvío miocárdico. En caso de infarto agudo de miocardio los niveles séricos troponina I aumentan dentro de las 3-6h tras iniciarse los síntomas cardíacos alcanzando su valor máximo pasadas unas 12-16h.

3. Documentos de consulta:

• Protocolo técnico del fabricante SIEMENS Dimensión EXL LOCI Module.
• Protocolo laboratorio de urgencias sección Bioquímica del Hospital del Meixoeiro.
• M.S. Moya Mir “Guía de exploraciones complementarias en urgencias”.
  www.formaciónsanitaria.com

4. Tipos de mustra:

Sangre total en tubo que contiene como aditivo heparina de litio. Ésta actúa inactivando la trombina y tromboplastina anticoagulando la sangre.

4.1. Recogida y conservación de la muestra:

 

Se centrifuga la muestra a 3.500 rpm. durante 10 minutos ó 3000 rpm. durante 15 minutos.

4.2. Procesamiento de la muestra:

 

Una vez centrifugada se retira el tapón del tubo ya que la aguja del Dimensión se puede romper, verificando que la muestra es suficiente y se pone con el código de barras hacia la luz roja que es el lector del aparato.

5. Reactivos:

 

El reactivo que usa es el de referencia EB1272TNI; el aparato Siemens hace saltar una alarma roja pidiendo el reactivo si no lo has puesto anteriormente. El reactivo está calibrado por los analistas. Éste es líquido pero también puede presentarse en pastillas.

6. Técnicas disponibles::

 

 

El método TNI de Dimension® es un inmunoensayo de quimioluminiscencia tipo sánwich homogéneo basado en la tecnología LOCI®. Los reactivos LOCI® incluyen dos reactivos sintéticos en microesferas y un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-troponina cardíaca .El primer reactivo en forma de miniesferas esta recubierto con estreptavidina y contiene un colorante fotosensible. El segundo reactivo en microesferas esta recubierto con un segundo anticuerpo monoclonal anti-troponina cardíaca y contiene un colorante quimioluminiscente.

La muestra se incuba con el anticuerpo biotinilado y con Chemibeads para formar sánwiches de microesfera –troponina cardíaca I- anticuerpo biotinilado. Se añaden Sensibeads, que se unen a la biotina para formar inmunocomplejos de pares de microesferas. La iluminación del complejo a 680nm genera oxígeno singulete de las Sensibeads que se difunde en las Chemibads y desencadena una reacción de quimioluminiscencia.

La señal resultante se mide a 612nm y es una función directa de la concentración de troponina cardíaca presente en la muestra.

El test Elecsys y Cobas Troponin I es un test inmunológico in Vitro para la determinación cuantitativa de la troponina I cardíaca en suero y plasma humanos. Éste ha sido concebido como un auxiliar en el diagnóstico y el tratamiento del infarto del miocardio y del daño muscular cardíaco. Emplea dos pares de anticuerpos monoclonales, dirigidos específicamente contra la troponina I cardíaca humana .Es una técnica sándwich con una duración total de 18 minutos. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración realizada en el sistema a partir de una calibración a dos puntos y una curva máster (calibración a 6 puntos) incluida en el código de barras del reactivo

7. Aparatos y material:

 

El equipamiento necesario para la realización de la determinación de las troponinas es el siguiente:

 

• Centrífuga
• Copas ssc para muestras escasas
• Pipetas Pasteur desechables
• Tubos eppendorf
• Cartucho de reactivos Flex® de TNI
• Equipo Dimension® EXL
• Sofware Sampel para validar los resultados.

 

 

 

8. Procedimiento:

 

Al ser una técnica automatizada se adjunta protocolo técnico del fabricante.

9. Control de calidad:

 

Al menos una vez por día de uso se analiza dos niveles de un material de control de calidad con concentraciones conocidas de troponina cardíaca I. Se hace control cardíaco por la mañana con el número 1, por la tarde se pone el número 2 y en el turno de noche con el control número 3.

10. Interpretación de resultados:

 

 

El aparato calcula la concentración de troponina en ng/Ml . Los resultados de esta prueba deberán interpretarse de acuerdo con la historia clínica del paciente.

Las muestras seriadas de un paciente con infarto de miocardio muestran el ascenso y disminución de concentración de troponina cardíaca I que se observa con otros marcadores del infarto como son la CK-MB. A diferencia de estos últimos los valores de troponinaI se suelen mantener elevados por encima del rango de referencia durante varios días.

Rango de medición analítico:

 

Se trata del rango de valores de analito que puede medirse directamente de la muestra sin necesidad de hacer diluciones ni tratamiento previo que no sea parte del proceso analítico habitual y que sea equivalente al intervalo del ensayo.

 

Dilución manual: diluir con diluyente de muestras TNI para obtener resultados dentro del rango informable. El factor de dilución recomendado es 1/5.Introduzca el factor de dilución en el instrumento. La lectura resultante se corregirá en función de la dilución.

Las muestras con resultados inferiores a 0.017ng/Ml deben registrarse como inferiores a 0.017ng/mL

El resultado obtenido es inferior al rango de ensayo.

11. Responsabilidades:

 

Como técnicos en laboratorio de análisis clínicos se tiene  la responsabilidad de diferenciar una muestra válida y rechazarla cuando no se puede procesar debido a la falta de información o la que trae no sea la correcta; identificar una alarma y conocer su significado; validar los resultados.

12. Anotaciones al procedimiento y limitaciones:

 

 

Las muestras de paciente puede contener anticuerpos heterófilos que podrían reaccionar en los inmunoensayos y dar resultados falsamente elevados o reducidos. Este análisis se ha diseñado para reducir al mínimo la interferencia causada por anticuerpos heterófilos.

El sistema de información del aparato contiene alarmas que nos proporcionan información sobre los errores del procesamiento del instrumento y posibles errores en los resultados de la troponinas.

13.  Bibliografía:

–  protocolo técnico del fabricante Dimension EXL

–  protocolo técnico del fabricante Cobas

 

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Bibliografía

1. Siemens Dimension EXL Loci Module. Protocolo técnico del fabricante

2. Cobas “Troponin I” Protocolo técnico del fabricante
www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/007452.htm

3. López – Sendón José. “Troponinas y otros marcadores de daño cardíaco” Revista española en cardiología. Enero 2003 vol. 56,nº1 http:www.elsevier.es/cardio/ctl.servlet

4. Ijaz A. Kha ”Aumento de la troponina no isquémico” Harrison Medicina.16 marzo 2007.
http://www.harrisonmedicina.com/updatescontent.aspx?aid=1001065

5. M.S.Moya Mir “ Guía de exploraciones complementarias en urgencias” www.formaciónsanitaria.com

6. José Ignacio Soler Díaz “Guía práctica. Marcadores bioquímicos cardíacos.Troponina. Mioglobina.
http://www.portalesmédicos.com/publicaciones/articles/712

7. Biblioteca Nacional de Medicina de EE.UU “Prueba de troponina” Medline plus www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish

8. García Rodríguez Carmiña; Martínez Maldonado Ivon “Ventajas del método de quimioluminiscencia” vol.2 nº2 La Paz 2009
http:www.revistasbolivianasorgbo/scielophp

9. Bernadó César, Gonzalez Elisabet, Vivas Eugenia”Troponinas en síndrome coronario agudo” www.fac.org.ar/fecforo/nursing/material